Badana oksydoreduktaza aldehydowa jest metaloenzymem zawierającym w swoim centrum aktywnym jon wolframu, który jest najcięższym pierwiastkiem pełniącym funkcję biologiczną w organizmach żywych. Enzymy wolframowe, które występują tylko w bakteriach i archeonach, charakteryzują się wysoką wrażliwością na tlen atmosferyczny oraz katalizują reakcje przy bardzo niskim potencjale redoks. 

AOR będąca obiektem badań została wyizolowana z mezofilnej i fakultatywnie anaerobowej bakterii Aromatoleum aromaticum (AORAa). AORAa  w istotny sposób odróżnia się od innej dobrze poznanej oksydoreduktazy AOR pochodzącej z hipertermofilnych archeonów. Jest znacząco mniej podatna na dezaktywację przez tlen atmosferyczny oraz posiada bardziej skomplikowaną strukturę podjednostkową (abg)2. AORAa katalizuje utlenianie szerokiej gamy aldehydów do odpowiednich kwasów wykorzystując barwniki wiologenowe lub  NAD+ jako sztuczne akceptory elektronów .[1]

 

 

​

​

​

​

​

​

Rys1. Schemat O2-niezależnej reakcji utleniania aldehydów do odpowienich kwasów karboksylowych katalizowany przez AOR. 

Niedawno odkryliśmy, że enzym może katalizować reakcję odwrotną, tzn. redukcję kwasów karboksylowych do aldehydów wykorzystując wodór cząsteczkowy jako reduktor [5]. Dzięki temu możliwe jest zastosowanie enzymu w syntezie aldehydów lub do czystego odtwarzania kofaktora NADH.  Odkrycie nowej aktywności enzymu oznacza również, że AOR jest nowym rodzajem hydrogenazy metalicznej zdolnej do utleniania cząsteczkowego wodoru do protonów i elektronów. 

​

Ponadto w kooperacji z centrum SYNMIKRO w MArburgu zdołaliśmy rozwiązać strukturę enzymu stosując technikę cryo-EM (Rys. 2). Ku naszemu zaskoczeniu enzym okazał się posiadać strukturę nano-drutu. Jego rdzeń zbudowany jest z ferrodoksynowych podjednostek AorA, które oligomeryzują w helikalną strukturę wypełnioną przewodzącymi elektrony centrami żelazo-siarkowymi. Rdzeń ten jest udekorowany katalitycznymi podjednostkami AorB, które zawierają kofaktor wolframowy, gdzie dochodzi do katalitycznego utlenienia aldehydów lub wodoru. Redukcja NAD+ do NADH zachodzi natomiast w podjednostce AorC, w centrum zawierającym kofaktor FAD [7]. 

​

​

​

​

​

​

​

​

​

 

 

 

 

 

 

Rys.2. Rekonstrukcja struktury AOR z Aromatoleum aromaticum uzyskana dzięki badaniom cryo-EM. Struktura enzymu przypomina nano-drut, gdzie  żółtym kolorem zaznaczono podjednostkę katalityczną (AorB) zawierającą kofaktor wolframowy (Wco - zielony) w centrum katalitycznym oraz jeden kaster Fe4S4, kolorem fioletowym podjednostkę transferująca elektrony (AorA) zawierającą cztery klastry Fe4S4,  zaś zielonym - podjednostkę zawierająca kofaktor FAD.

​

Naszym celem jest dalsza charakterystyka katalityczna enzymu ze szczególnym uwzględnieniem badań aplikacyjnych ukierunkowanych na reakcje kaskadowe (wykorzystujące AOR do syntezy aldehydów, następnie przetwarzanych przez inne enzymy do wartościowych związków) oraz opracowania ekologicznego systemu odtwarzania kofaktora NADH za pomocą wodoru. Zamierzamy również poznać mechanizm reakcji katalizowanej przez AOR stosując badania kinetyczne oraz modelowanie molekularne.

​

Jak dotoąd badania były wykonywane przy wsparciu finansowym grantu NCN PRELUDIUM No 2017/27/N/ST4/02676: ‘Wolframowa oksyreduktaza aldehydu z Aromatoleum aromaticum – badania mechanizmu reakcji katalitycznej’ oraz w ramach projektu POWER „Fizyczne, Chemiczne i Biofizyczne Podstawy Nowoczesnych Technologii i Inżynierii Materiałowej”  FCB. Obecnie badania wykonywane są w ramach grantu NCN OPUS  2023/51/B/ST4/01224 pt. "Wolframowa Oksydoreduktaza Aldehydów - nowa hydrogenaza. Badania mechanizmu reakcji i potencjalnych zastosowań biokatalitycznych."

​

Lista publikacji:

1. F.  Arndt , G. Schmitt, A.  Winiarska, M. Saft, A. Seubert, J. Kahnt,  J. Heider,   Characterization of an Aldehyde Oxidoreductase From the Mesophilic Bacterium Aromatoleum aromaticum EbN1, a Member of a New Subfamily of Tungsten-Containing Enzymes. Front. Microbiol., 10 (2019) 71. doi: 10.3389/fmicb.2019.00071

2. A. Winiarska, J. Heider, M. Szaleniec. D. Hege, F. Arndt „Sposób otrzymywania aldehydów poprzez enzymatyczną redukcję kwasów karboksylowych”, Polish Patent Application P.437445 (29.03.2021)

3. A. Winiarska, J. Heider, M. Szaleniec. D. Hege, F. Arndt „Sposób enzymatycznej redukcji formy utlenionej dinukleotydu nikotynowo-adeninowego.” Polish Patent Application P.437449 (29.03.2021)

4. A. Winiarska, J. Heider, M. Szaleniec. D. Hege, F. Arndt, A. Wojtkiewicz „A method of enzy-matic reduction of the oxidized nicotinamide adenine dinucleotide and carboxylic acids”, European Patent Application EP22164459.4

5. A. Winiarska, D. Hege, Y. Gemmecker, J. Kryściak-Czerwenka, A. Seubert, J. Heider, M. Szaleniec, Tungsten Enzyme Using Hydrogen as an Electron Donor to Reduce Carboxylic Acids and NAD+, ACS Catalysis, 2022, 12 (14), 8707-8717, doi: 10.1021/acscatal.2c02147

6. P. Kalimuthu, D. Hege, A. Winiarska, Y. Gemmecker, M. Szaleniec, J. Heider, P. V. Bernhardt, Electrocatalytic Aldehyde Oxidation by a Tungsten Dependent Aldehyde Oxidoreductase from Aromatoleum Aromaticum, Chem. Eur. J. doi: 10.1002/chem.202203072

7. A. Winiarska, F. Ramrez-Amador, D. Hege, Y. Gemmecker, S. Prinz, G. Hochberg, J. Heider, M. Szaleniec, J. Michael Schuller, “A bacterial tungsten-containing aldehyde oxidoreductase forms an enzymatic decorated protein nanowire”, Science Adv. 9 (2023) eadg6689. DOI: 10.1126/sciadv.adg6689

​